Une nouvelle sonde locale pour la microscopie à force atomique en milieu biologique

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1 Une nouvelle sonde lole pour l mirosopie à fore tomique en milieu iologique Jérôme POLESEL-MARIS et Thoms BERTHELOT CEA, IRAMIS, Servie de Physique et Chimie des Surfes et Interfes, Gif-sur-Yvette jerome.polesel@e.fr, Les tehniques d nlyse sées sur l mirosopie à fore tomique (AFM) pour les mesures de fores loles en milieu physiologique ouvrent de nouvelles opportunités de rtéristion pour l nno-médeine et le dignosti personnlisé. Les nno-pteurs de fore détetnt des intertions moléulires spéifiques ligndprotéine peuvent être utilisés pour l ingénierie phrmeutique ou l détetion de io-mrqueurs. Ces mesures de fore spéifiques permettent de mieux omprendre les ménismes de déstilistion des protéines dns ertines pthologies, et pr quels ménismes ertines moléules se lient entre elles et modulent les réepteurs trnsmemrnires des ellules. En prllèle, l rtogrphie AFM déjà démontré s pité d imgerie de hute résolution de strutures périodiques de protéines, ou de protéines isolées, sns uun équivlent instrumentl. Aujourd hui, les nno-pteurs à détetion intégrée ugurent d une nouvelle génértion de mirosopes à fore tomique repoussnt les limites tuelles. L mirosopie à fore tomique Le développement de l mirosopie à effet tunnel (snning tunneling mirosopy, STM) et ensuite de l mirosopie à fore tomique (tomi fore mirosopy, AFM) dns les nnées 80 représenté l perée l plus signifitive des nnosienes, sinon leur vri point de déprt. Pour l première fois, il étit possile d oserver les tomes de surfes plnes dns l espe réel, de mesurer des fores d intertion u niveu de l moléule, et de mnipuler l mtière à l éhelle tomique. Depuis 1991, sous l première impulsion d Andres Engel (Université de Bâle, Suisse), l AFM été exploitée ve suès pour l étude du monde iologique. L verstilité de l instrument permis l étude de différents ojets iologiques de l protéine isolée ux tissus de ellules dns leur environnement de survie [1]. L reltive simpliité de préprtion de l éhntillon dns son milieu iologique, sns néessité de mrquge pour le suivi, ontrirement pr exemple à l mirosopie pr fluoresene, fit que et instrument trouve ujourd hui s ple dns les lortoires et industries en iotehnologies. Dns le pysge des tehniques de hmp prohe dérivnt de l AFM, les instruments dédiés à des pplitions iologiques spéifiques représentent une grnde f - mille de dispositifs. Un nouveu type de sonde lole à pteur intégré piézoéletrique Réemment, un intérêt roissnt est né pour une trnsition des sondes loles mirométriques vers des sondes nnométriques pour ugmenter les tux d quisition des données, méliorer l résolution de détetion en fore et ouvrir l voie à des rtéristions à très hute vitesse de l inétique des protéines. Ces prolémtiques de vitesse ont été prtiellement résolues ve l rrivée réente d un ertin nomre de prototypes d AFM dits «ultr-rpides» (ou «high speed AFM»). Des tux d quisition de l ordre de l entine de milliseondes pr imge ont été tteints. Ces nouvelles tehniques néessitent l utilistion de miro-leviers AFM plus petits que l dizine de mirons pour onserver une hute sensiilité de détetion en fore ve de hutes fréquenes de fontionnement de l ordre du méghertz ou plus. Cependnt, l détetion optique onventionnelle pr fiseu lser (endré 1) pour déteter le mouvement du miro-levier AFM rrive ujour - d hui à ses limites pour implémenter des sondes dont les dimensions ne sont que de l ordre de quelques longueurs d onde. De nouvelles méthodes de détetion et de nouveux types de sondes AFM doivent don être mis en œuvre et optimisés pour l prohine génértion d instruments à sonde lole. Nous vons mis u point un nouveu mirosope à sonde lole (figure 1) permettnt l rtéristion fine d ojets iologiques pr imgerie hute résolution et spetrosopie de fore à l éhelle de l protéine [2]. Le œur de e mirosope à sonde lole est un dipson piézoéletrique en qurtz (endré 2), mintenu en osilltion en solution, sur lequel est fixée une pointe métllique d pex Artile disponile sur le site ou

2 Endré 1 Historiquement, le mirosope à fore tomique été inventé en 1986 pr Gerd Binnig (Prix Noel de Physique), Christoph Gerer et Clvin Qute. Mis 1988 représente le réel point de déprt de l démortistion de ette mirosopie dns les lortoires grâe u développement de l détetion optique externe du mouvement du mirolevier. Ce prinipe ingénieux été inventé pr Gerhrd Meyer et Nil Amer ux lortoires d IBM Zürih en Suisse. Cette onversion méno-életrique se fit vi un système de soure lumineuse fixe (lser ou diode életroluminesente (LED)) dont le fiseu est réfléhi pr le ntilever sur une photodiode à qutre qudrnts fixe. Ces qudrnts du réepteur permettent de déteter soit les torsions ltérles de l poutre soit les déflexions normles. Les ntilevers utilisés dns e système sont générlement en siliium. Les dimensions du ntilever sont de l'ordre de l entine de mirons en longueur pour quelques dizines de mirons en lrgeur. Une pointe pyrmidle d'environ une dizine de mirons en huteur se trouve à Détetion optique des mirosopes à fore tomique Figure 1.. Prototype du nouvel AFM à sonde lole piézo - életrique.. Détil du dipson en qurtz supportnt l pointe métllique millimétrique.. Détil de l pex de l pointe de quelques dizines de nnomètres de ryon. l'extrémité de l miro-poutre. C'est l'pex de ette pointe qui v sruter l surfe de l'éhntillon et de lui dépendr en grnde prtie l qulité des imges otenues. L'AFM peut être utilisée en mode sttique, ppelé mode Contt, pr mesure direte des fores de surfes, ou en mode dynmique pr entretien de l osilltion du ntilever à une fréquene prohe ou égle à s fréquene de résonne. Dns e dernier mode de fontionnement les propriétés de résonne (mplitude, fréquene ou phse) de l sonde osillnte sont modifiées pr le grdient des fores de surfe. nnométrique otenu pr ttque életrohimique. L utilistion vntgeuse du dipson permet de s ffrnhir de l trditionnelle détetion optique des AFM, et permet une très grnde souplesse qunt u hoix du type de pointe utilisée (mtériux, formes). L spet innovnt du système réside dns l utilistion d une telle sonde pour explorer le monde iologique à l éhelle de l protéine. Ce nouvel instrument ouvre l voie à des études fondmentles en iologie pour permettre une ompréhension plus ultime des ménismes d éhnge donneur/epteur Endré 2 Le dipson piézoéletrique, un pteur très sensile Depuis le milieu des nnées 1990, plusieurs équipes sientifiques ont proposé l utilistion prllèle de sondes AFM à pteurs intégrés piézorésistives et piézoéletriques pour rtériser l mtière sous environnement ultr vide. Frnz Giessil (Université de Augsurg, Allemgne) notmment démontré, u moyen de sondes piézoéletriques AFM, un très hut niveu de sensiilité de détetion permettnt d otenir l résolution tomique sur une surfe de siliium. L prtiulrité de es sondes AFM est qu elles sont diretement rélisées à prtir d un résonteur en qurtz millimétrique sous forme de dipson provennt de l industrie horlogère. Une pointe métllique de longueur millimétrique ve un pex nnométrique est ensuite ollée sur un des rs du dipson. Le pln de déoupe AT du qurtz, l hute onstnte de rideur de plusieurs kilonewtons/mètre et le grnd fteur de qulité de es résonteurs prourent une grnde stilité de fontionnement et une hute sensiilité de détetion. L effet piézoéletrique diret est un phénomène rtérisé pr l'pprition de hrges életriques à l surfe de ertins ristux lorsqu'ils sont soumis à une ontrinte ménique. L flexion de l struture moile v générer une ontrinte dns le mtériu piézoéletrique, ii du qurtz, qui v se trduire pr l pprition de hrges u niveu des életrodes. Il fut noter que e mode de détetion est peu utilisé pour les mesures sttiques de flexion à use de ournts de fuites importnts mis est pr ontre ien dpté pour les mesures en mode dynmique. dns ertines rétions enzymtiques de tlyse, ou des intertions spéifiques d ntigènes ve les ntiorps à l se de l reonnissne de pthologies, mis sur des quntités moléulires. Ce système nous déjà permis de vlider et reveter ertines méthodologies 52

3 inédites de préprtion de es nouvelles sondes pour le milieu iologique [3], en prtiulier l fontionnlistion iohimique des pointes, et les protooles pour l pssivtion des életrodes du pteur intégré, évitnt insi les prolèmes de fuites életriques et de orrosion lors de l immersion en solution sline (figure 2). En onsidérnt es nouveux omportements de l sonde en solution, nous vons don hngé l strtégie de pilotge du résonteur piézoéletrique ve une nou- Figure 2. Illustrtion du omportement de l sonde lole AFM piézoéletrique pssivée en solution tmpon. Les propriétés de résonne sont modifiées pr les effets hydrodynmiques du milieu liquide. velle életronique. Un prémplifiteur dédié été rélisé pour triter des signux de très s niveu (piompère) issus du dipson piézoéletrique ve une nde pssnte tteignnt les 5 méghertz. Cel nous permis de retrouver une sensiilité en détetion de fore de l ordre de 80 pionewtons, omprle ux systèmes AFM onventionnels. Résultts sns préédents sur l protéine ve une sonde AFM piézoéletrique L spetrosopie de fore iohimique L étude des intertions des protéines d lumine ve différentes fontions himiques revêt une grnde importne pour l ompréhension de nomreux systèmes iologiques, insi que pour méliorer les surfes d immoilistion de iomoléules pour les iotehnologies. Pr exemple, les intertions hydrophiles/ hydrophoes entre des protéines et des surfes de mtériux jouent un rôle extrêmement importnt dns un grnd nomre de domines omme l io - omptiilité d implnts, l dhésion des iomtériux ou l ingénierie de tissus ellulires. Nous vons insi étudié pr spetrosopie de fore iohimique l dénturtion ménique de protéine BSA (ovine serum lumine) pr liisons non-spéifiques en utilisnt des pointes fontionnlisées ( OH, CH3 et NH2) sur une sonde AFM piézoéletrique sée sur un dipson en qurtz. Pour ette étude, es protéines d lumine ont été préllement fixées de mnière ovlente sur un sustrt de mi doré u moyen d une himie «GrftFst» sée sur l tivtion en deux temps de sels de dizonium (figure 3). L petite himie de Muriel CHIRON-CHARRIER Illustrtions de Wieke Drenkhn Cfé, rème, svon et C ie du mtin Mrie Curieuse Sur un ton à l fois DRÔLE ET SÉRIEUX, l uteure nous fit déouvrir l histoire d un produit, les origines de ses omposnts, les rétions himiques pour rriver à un tel résultt et son utilistion... ref l PETITE CHIMIE DU MATIN! Chque prtie est onstruite utour d une thémtique. Les explitions sont lires et onises et les ILLUSTRATIONS délées nous emportent dns le monde de Mrie Curieuse., Figure 3. Chimie de greffge ovlent des protéines d lumine BSA sur une surfe de mi doré, utilisnt l doule tivtion de sels de dizonium. ISBN : Prix :

4 Figure 4. Coures de spetrosopie d pprohe (en noir) et de retrit (en rouge) sur une surfe de protéines d lumine BSA u moyen de trois pointes fontionnlisées différemment : () terminison hydrophile hrgée NH2, () terminison hydrophile neutre OH, () terminison hydrophoe CH3. Une himie similire été ensuite mise en œuvre pour doter l pex de l pointe AFM nnométrique de fontionnlités himiques à rtère hydrophile (fontion OH, fontion NH2) ou hydrophoe (fontion CH3). Des oures d pprohe et de retrit ont ensuite été rélisées sur l même surfe de protéines BSA en utilisnt les trois types de pointe (figure 4). L utilistion du mode AFM dynmique proure une informtion ouplée d mplitude et de phse, permettnt de luler les intertions d rohge entre les protéines et l pointe AFM fontionnlisée. Un tritement nlytique permet de onvertir les données d mplitude et de phse en vleurs de fore plus représenttives. Les oures d pprohe (en noir) illustrent une rédution de l mplitude d osilltion et une ugmenttion du signl de phse, toutes deux provoquées pr une ompression ménique de l pointe sur l surfe. Durnt ette phse, différents liens himiques se réent entre les fontions himiques de l pointe et les protéines de surfe. Dns un deuxième temps, l pointe est retirée de l surfe tout en enregistrnt les signux d mplitude et de phse (oures en rouge). On met insi en évidene des phénomènes de suts et d hystérèse, pr rpport à l oure d pprohe, pour ertines fontions himiques (ii NH2 et CH3). On insi une signture qulittive d ffinité d intertion ve l protéine. Cette séquene est ensuite répétée une entine de fois pour révéler une distriution sttistique des fores mises en jeux durnt es suts non-linéires lors du retrit de l pointe. L sttistique de es mesures fournit les distriutions des fores de rupture (figure 5) pour hune des trois pointes ynt opéré sur l même surfe de protéines. Les fontions himiques CH3 et NH2 présentent deux pis de fore de déthement. Ces résultts nous informent que les intertions purement Figure 5. Distriutions des fores de rupture ve les protéines BSA pour les trois types de terminisons himiques des pointes, otenues sur une olletion d une entine de oures de retrit. hydrophoes ve l fontion CH3 et l protéine sont similires qulittivement et quntittivement ve l terminison himique NH2, qui est du type hydrophile mis hrgée dns les onditions de l solution tmpon utilisée. Les intertions pr l fontion OH purement hydrophile et neutre ve l protéine ne sont pr illeurs ps déelles omme le montre le troisième histogrmme. Les deux pis de distriution des fores pour les fontions CH3 et NH2 ont pour origine un ménisme de dénturtion ménique de l protéine en deux temps que nous shémtisons sur l figure 6. Durnt le retrit de l pointe, les déthements séquentiels des liisons himiques internes de file énergie de l protéine (typiquement des liisons hydrogène) pprissent omme des intermédiires de suts de fore de l ordre de l entine de pionewton. Dns un deuxième temps, des suts de fore plus onséquents (entre 630 et 830 pionewtons) témoignent du déthement de domines entiers de l protéine. Cette linéture se poursuit jusqu u Figure 6. Shém expliqunt l origine des deux pis révélés dns les distriutions des fores de ruptures (ii ve l pointe fontionnlisée NH2). 54

5 déthement omplet de l protéine de l pointe fontionnlisée. L imgerie hute résolution de protéines isolées L mirosopie à fore tomique permet de ompléter de mnière unique l rsenl des outils d études de l iologie struturle (ryons X, RMN) en permettnt l rtogrphie en topogrphie d une seule iomoléule (protéine ou ide nuléique (ADN)). Nous vons insi évlué l pité de notre dispositif à sonde piézoéletrique pour l imgerie hute résolution des protéines de petite tille ve une morphologie struturée. Nous vons étudié l topogrphie des deux types d ntiorps immunoglouline G (IgG) et immunoglouline M (IgM) dsorés sur une surfe de mi. En effet, les ntiorps sont des protéines présentes dns le sng, qui jouent un rôle importnt dns l défense immunitire de l orgnisme lors d gression pr des virus ou des téries pr exemple. Les ntiorps sont utilisés pr le système immunitire pour déteter et neutrliser les gents pthogènes de mnière spéifique. Ces ntiorps peuvent exister sous formes de monomères (IgG), dimères (IgA) ou pentmères (IgM). L topogrphie des IgG dsorés, otenue ve notre instrument AFM sur une surfe de mi (figure 7), montre que es protéines doptent une struture sous forme de Y ve trois loes. Nous vons pu démontrer que les IgG peuvent dopter différentes orienttions dues à leur d - sorption létoire à l surfe du mi. L struture ristllogrphique onnue de d Figure 7. À guhe, rtogrphies AFM d ntiorps IgG isolés suivnt plusieurs orienttions sur l surfe. À droite, résultts de ristllogrphie orroornt les données otenues en topogrphie AFM. es ojets permet de l orréler diretement ux orienttions de l protéine oservées pr AFM. Pour ller plus loin dns l pité de notre sonde piézoéletrique AFM à résoudre ve une hute résolution des protéines de struture plus omplexe et plus frgile que les IgG, nous vons ussi rtérisé des ntiorps IgM. Ces ntiorps possèdent une struture pentmérique qui se ompose de inq sous-unités IgG liées les unes ux utres de fçon ovlente pr des ponts disulfures ve une glyoprotéine entrle ppelée hîne J. L topogrphie des IgM dsorés à l surfe de mi (figure 8) montre des strutures pentmériques ve des strutures de morphologies vriées. Ces dernières Figure 8.. Crtogrphie AFM d ntiorps IgM regroupés dns un ms.,. Deux imges à hute résolution AFM d ntiorps monolonux IgM isolés, permettnt d éluider des nomlies struturelles. d pourrient être expliquées pr une orienttion différente des IgM à l surfe. Les détils () et () montrent lirement des strutures d IgM présentnt des nomlies struturelles grâe u pouvoir en résolution de notre mirosope. Ces nomlies vient déjà été suodorées dns l littérture mis sns jmis d oservtion direte u niveu d une protéine isolée tel que nous y sommes prvenus. Ces essis préliminires de pité de résolution en fore et en topogrphie sns préédent vont désormis nous permettre d ller plus loin dns l étude d spets plus fondmentux onernnt les intertions spéifiques entre un lignd et une protéine. Ces informtions de liisons spéifiques seront ouplées à de l im - gerie hute résolution de l protéine pour oserver in situ les hngements stru - turels pr vrition des prmètres du prohe environnement (ph, tempérture, présene d nlytes ). Ces études fondmentles pr AFM permettront une ompréhension plus ultime des ménismes mis en œuvre lors d intertion protéine/ lignd dns les rétions enzymtiques, ou lors d intertions spéifiques ntiorps/ntigènes à l se de l reonnissne de pthologies mis sur des quntités moléulires, y ompris en solutions turides peu filtrées. L pport de l sonde AFM à pteur intégré piézoéletrique ser ussi vntgeux pour étudier sous osurité totle des systèmes iologiques photosensiles (pr exemple les ménismes de photosynthèse). Référenes [1] D.J. Müller, Y.F. Dufrêne, Atomi fore mirosopy s multifuntionl moleulr toolox in nnoiotehnology, Nture Nnotehnology 3, (2008), doi: /nnno [2] Interview rdiodiffusée sur Frne Info (pr Mrie-Odile Monhiourt): «Un nouvel instrument pour sruter le nnomonde», émission du 16 février info-sienes/un-nouvel-instrument-pour-sruterle-nnomonde [3] J. Polesel-Mris, J. Legrnd, Th. Berthelot, A. Gri, P. Viel, A. Mkky, S. Plin, Fore Spetrosopy y Dynmi Atomi Fore Mirosopy on Bovine Serum Alumin proteins hnging the tip hydrophoiity, with piezoeletri tuning fork self-sensing snning proe, Sensors nd Atutors B: Chemil 161, (2012), doi: /j.sn