Lasers multicolores pour le diagnostic cellulaire
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- Oscar Bonin
- il y a 8 ans
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1 Lsers multicolores pour le dignostic cellulire Nelly RONGEAT et Philippe NERIN Hori Medicl Vincent COUDERC et Philippe LEPROUX XLIM Guillume HUSS Leukos Le dignostic cellulire est ctuellement sé sur les mesures électriques et optiques de multiples prmètres ssociés ux cellules constitunt le sng. L utilistion de l technique de l cytométrie en flux permet d otenir rpidement les crctéristiques de chque cellule grâce à leur défilement contrôlé devnt une ou plusieurs fenêtres d nlyse : on mesure insi leur tux de fluorescence, leur diffrction ou leur impédnce. Pour cel l cominison de plusieurs sources lser émettnt des ryonnements continus à différentes longueurs d onde est nécessire mis reste reltivement complexe et coûteuse. L rrivée sur le mrché de sources multicolores ultrcompctes (de type continuum) permet une méliortion significtive du système d excittion optique ce qui v contriuer à otenir un meilleur dépistge des mldies snguines. Le choix plus grnd des longueurs d onde et l mîtrise prfite de leur écrtement spectrl pportent de nouvelles solutions pour l discrimintion cellulire et cel vec une précision ccrue. Figure 1. Représenttion schémtique du prcours de soin. L sitution ujourd hui Un mrché très importnt En Frnce, les nlyses médicles re - présentent 2,5 % des consommtions de soins et de iens médicux, soit 4,5 Md sur les 175,7 Md (2009) que représentent l ensemle des investissements. Nénmoins, ces dépenses liées u dignostic influencent 70 % des décisions médicles constitunt insi un poste de coût qui pèse fortement sur les collectivités. De plus, ces dépenses ne cessent de croitre dns les pys de l OCDE vec une progression de près de 10 % entre 2000 et Cette tendnce glole montre une réelle nécessité d méliorer le dépistge des mldies fin de pouvoir endiguer, très précocement, toute ggrvtion et prolifértion. Pour cel une méliortion des mtériels de dignostic doit notmment être rélisée. En prticulier, des nlyseurs d hémtologie, cples en moins de quelques secondes de crctériser plusieurs dizines de sous-popultions cellulires et d identifier une cellule normle prmi plusieurs milliers ou millions, doivent être développés. Processus de dignostic et de soin L cte de dignostic commence le plus souvent pr un prélèvement snguin (figure 1). Celui-ci est nlysé pr un utomte d hémtologie qui fournir dns un premier temps une nlyse «de routine» des constitunts du sng. Le prticien se livre lors à une première interpréttion des résultts : si les résultts ne mettent ps en évidence d nomlie, le ptient n ur ps de tritement, si le prticien peut fire un dignostic à l ide des résultts, il peut, en générl, prescrire un tritement dpté. Mis dns certins cs, les résultts ne peuvent montrer qu une nomlie sns pouvoir donner d informtion directe sur le dignostic. Dns ces conditions, le prticien v être oligé de prescrire une nouvelle nlyse, cette fois vec un ppreil plus complexe qui est ppelé un cytomètre. Cet ppreil coûteux n est 50 Article disponile sur le site ou
2 Prise de sng CAHIER TECHNIQUE Insertion dns l nlyseur Figure 2. Photo d une prise de sng et d un nlyseur d hémtologie. Figure 3. Photo du système hydrodynmique. Figure 4. Représenttion i-prmétrique ou mtrice. générlement disponile que dns certins lortoires spécilisés et nécessite l emploi d un technicien hutement qulifié. Cel se trduit notmment pr le trnsport des échntillons de sng vec le risque d une détériortion de leur qulité et un coût d nlyse élevé. Cette seconde étpe permet u médecin d étlir un dignostic définitif et de proposer un tritement dpté. Au cours du tritement, le cycle de prise en chrge peut être réitéré, si cel est nécessire, fin de s ssurer de l onne efficcité du tritement. Les ppreils de dignostic Les ppreils de dignostic ctuels sont prticulièrement complexes et permettent de réliser des tests snguins ou des nlyses pour le suivi de pthologies spécifiques. Ils sont constitués de plusieurs prties relevnt toutes d un domine technique (l physique, l chimie, l mécnique, l fluidique, l informtique, l électronique ). Concernnt les nlyseurs d hémtologie, les crctéristiques les plus importntes pouvnt ctuellement être méliorées sont notmment : l sensiilité fin de dépister très précocement les mldies, l rpidité, l cpcité à réliser un grnd nomre de tests simultnément. Le coût de ces ppreils doit églement être risonnle fin de permettre à tous d voir ccès ux soins. Le principe d un nlyseur d hémtologie À l suite d une prise de sng clssique, le tue de sng est introduit dns l ppreil (figure 2). Le sng (composé des cellules et du plsm) est trnsféré dns le cœur nlytique de l mchine près cheminement dns différents circuits hydruliques. Le sng est mélngé vec un réctif puis mené u niveu de l cuve de mesure. Dns un second temps, les cellules sont foclisées hydruliquement grâce à des liquides que nous ppelons liquides de ginge, et qui permettent de fire défiler les cellules les unes près les utres devnt une première fenêtre de mesure électrique puis une seconde fenêtre d illumintion optique (figure 3). Ces mesures donnent des informtions sur l tille de l cellule, sur s grnul- rité, sur son contenu intrcellulire ou sur s nture. Il est lors possile de les discriminer suivnt des ctégories et d fficher ces résultts sur un «simple» hémogrmme. Ces résultts sont ensuite trités pr des lgorithmes permettnt d otenir des représenttions i-prmétriques (figu - re 4), et de clsser et comptiliser les différentes sous-popultions cellulires fin de détecter un éventuel déséquilire des constitunts du sng. Il est à noter que les nlyses optiques dns un nlyseur d hémtologie utilisent l pluprt du temps une seule source lumineuse (figure 5). Pr contre, plusieurs lsers, émettnt un ryonnement cohérent à différentes longueurs d onde, sont géné rlement intégrés dns les cytomètres en flux pour otenir une identifiction Figure 5. Exemple de système optique intégré dns un nlyseur d hémtologie. 51
3 Figure 6. Spectres d sorption et d émission de deux fluorochromes. Représenttions des longueurs d onde d excittion lser, 1 et 2. Figure 7. Deux excittions cominées permettent de discriminer les éosinophiles et les sophiles prmi les utres leucocytes. de multiples fluochromes spécifiques de certines cellules et cel grâce à plusieurs tritements chimiques préliminires. Améliortion de l précision du dignostic cellulire Grâce à plusieurs sources lumineuses L ssocition de sources lsers émettnt des ryonnements lumineux de différentes couleurs et de différentes intensités permet d méliorer fortement l séprtion de popultions ou sous-popultions cellulires, surtout qund les fluorescences ont des intensités éloignées. Ceci permet d juster les niveux de fluorescence des deux fluorochromes utilisés (figure 6). Ce type de discrimintion est sé sur des mesures électriques d impédnce et des mesures optiques de diffrction et de fluorescence. L discrimintion des éosinophiles et des sophiles prmi les utres leucocytes (c est-à-dire les monocytes, neutrophiles, lymphocytes, immtures grnuleux, cellules à hute teneur en cides nucléiques) peut être fortement méliorée en utilisnt deux excittions cominées grâce à un modulteur cousto-optique (figure 7). Grâce à un système d identifiction pr codge L discrimintion de deux types de microsphères fluorescentes peut églement être otenue en utilisnt une source lser émettnt deux rditions synchrones (491 et 532 nm). Le codge est effectué grâce à un modulteur cousto-optique, les modultions de l intensité sous forme sinusoïdle, à des fréquences 1 et 2 sont ssociées respectivement ux longueurs d onde d émission lser 1 et 2. Le co - dge de chque signl optique incident permet de discriminer les signux de fluorescence provennt de différents types de microsphères mlgré le recouvrement de leurs spectres de fluorescence (figure 8). Cette nouvelle technique de codge spectrl ouvre l voie à de nouveux xes de recherche et permet d méliorer l précision du dignostic dns le domine de l hémtologie. Exploittion d une source lser multilongueur d onde pour le dignostic cellulire L utilistion de plusieurs sources lumineuses u sein d un système d nlyse engendre de l instilité opto-mécnique et les longueurs d onde fixes des sources lsers ne permettent ps d exciter les cellules vec l précision spectrle nécessire. L utilistion d un système unique cple d engendrer un grnd nomre de longueurs d onde (sources lnches cohérentes) permet de contourner efficcement ces prolèmes et d méliorer sensilement l précision des systèmes d nlyse. Une découpe ultrrpide du spectre d émission (utilistion d un modulteur optique) permet d otenir un peigne de fréquences justle et de gérer, en temps réel, l mplitude de chque onde. Les sources lsers de type super-continuum, sées sur l utilistion d un microlser et d une simple fire micro-structurée, 52
4 Figure 8. Exemples de () signl modulé détecté sur un cnl et correspondnt à une microsphère, () signl utile extrit à prtir du signl (). Figure 9. Exemple de supercontinuum (XLIM, Leukos) : () le lser utilisé et () son spectre d émission. constituent donc un outil de choix. Ces émetteurs polychromtiques, développés et commercilisés, dns notre cs, pr le lortoire XLIM et l jeune société Leukos (figure 9), offrent des performn - ces excellentes en termes de stilité d mplitude, de lrgeur spectrle et de densité de puissnce. Les systèmes lsers minitures sont églement des systèmes déclenchés. Hori Medicl donc CONTACT TM Composnts optiques de qulité, opto-mécnique, sous-ensemles Notre équipe de conseillers techniques est à votre disposition Tel Tél. : +44 : BertrndMrcillud@knightopticl.co.uk BertrndMrcillud@knightopticl.co.uk knightopticl.com CAHIER TECHNIQUE 53
5 Des trvux menés dns le cdre du projet NextGenPCF Les résultts présentés dns cet rticle ont été otenus lors de l thèse de doctort de Nelly Ronget dns le cdre d une ourse CIFRE et d un prtenrit entre l société Hori Medicl spécilisée dns le dignostic en hémtologie, et l Université de Limoges (lortoire XLIM). Ces trvux de recherche se sont déroulés en prtie dns le cdre du projet européen NextGenPCF (Next Genertion Photonic Cristl Fier FP6) qui vit pour ut de développer de nouvelles fires optiques micro-structurées en silice et de démontrer leur utilité dns l rélistion de sources lsers multicolores ppliquées u dignostic cellulire. Le consortium de NextGenPCF rssemlit dix-huit groupes de recherches industriels et cdémiques prmi lesquels Hori Medicl (Montpellier), Drk Comteq, Leukos (Limoges), l Université de Lille (Phlm), l Université de Limoges (XLIM), l Université de Jen (Allemgne) ou encore l Université de Bth (Angleterre). Figure 10. Discrimintion de différentes popultions leucocytires grâce à un nlyseur d hémtologie intégrnt une source de lumière «lnche». dpté ces nlyseurs cellulires pour permettre l synchronistion d une impulsion lser unique vec une cellule iologique. Ce processus d nlyse, sé sur le principe : «une cellule une impulsion», utilise l mesure d impédnce électrique comme moyen de synchronistion. L émission qusi-continue de ces lsers permet lors l éclirge systémtique de chque cellule et cel vec un tux d illumintion identique et précis. Cette source lnche églement été dptée en termes de structure modle pour chque longueur d onde fin de permettre l rélistion d une mesure de diffrction en lumière lnche. Une fire multimode à profil rectngulire est lors utilisée comme rouilleur de modes ce qui minimise les effets chromtiques liés à l illumintion de l fenêtre optique. Le prélèvement d une longueur d onde dns le leu (utour de 482 nm) pr exemple permis d otenir une excellente discrimintion des lymphocytes, des monocytes, des grnulocytes, des grnulocytes immtures et des cellules à hute teneur en cides nucléiques (telles que les lympholstes, les monolstes et les plsmocytes). Perspectives L utilistion de sources multi-longueurs d onde dns des nlyseurs cellulires conduit à de réelles vncées en termes de dignostic de précision. Le coût de ces sources reste tout à fit ordle et permet d otenir suffismment de densité spectrle de puissnce pour grntir des nlyses de fluorescence vec un excellent rpport signl sur ruit. L fréquence optimle de ces sources est directement liée à l sttistique de pssge des cellules dns l fenêtre de mesure et reste dns un ordre de grndeur cceptle pour des sources minitures déclenchées ctivement et pssivement ( 20 khz). Hori Medicl souhite poursuivre l étude de l implnttion des sources polychromtiques dns ses nlyseurs. Des tests cliniques systémtiques devrient églement vlider de mnière forte ces nouveux systèmes. Hori Medicl d illeurs effectué une demn de de suvention uprès d OSEO dns le cdre des projets de type ISI (Innovtion Strtégie In - dustrielle) fin de poursuivre ces investigtions. Ce projet, dt@dig, été ccepté et déuté le 1 er jnvier 2012 et cel en prtenrit vec, entre utres, l Université de Limoges. Il v permettre de poursuivre les efforts de recherche présentés ici pour outir à des produits innovnts et performnts. Ces dispositifs de dignostic permettront de ggner en précision sur l ide u dignostic et le suivi thérpeutique, et donc de détecter plus fcilement des mldies spécifiques pour mieux les comttre, fin d ccroître l durée de survie des ptients. Hori Medicl Hori Medicl, dont le siège socil est situé à Montpellier, fit prtie du groupe jponis Hori qui compte environ 5000 personnes réprties dns 25 pys dns le monde. Hori Medicl est spécilisée dns l conception et l friction de systèmes d nlyse in vitro ppliqués à l hémtologie et l iochimie, et compte 800 personnes dont près de 600 sur le site du siège socil. Sur le mrché du dignostic hémtologique, et en termes de production d instruments, Hori Medicl occupe une plce prépondérnte en Europe et est le 3 e cteur mondil. 54
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